我们能从自闭症的小鼠实验能得到什么

Stephanie Seneff
[email protected]
2018年2月1日

 

Original Source:  http://people.csail.mit.edu/seneff/mouse_models_autism.html

 

1. 引言
自闭症是一种复杂的神经发育障碍类疾病,其发病率在过去二十年中急剧上升。这与主要粮食作物中草甘膦含量增加密切相关(许多除草剂中的有效活性化学成分)[1,2]。虽然暂未发现以上关系是自闭症的起因,但草甘膦对人类身体以及肠道微生物的影响是导致许多的与自闭症相关疾病的诱因[3,4]。

值得注意的是,小鼠可以患上类似人类自闭症的疾病,研究人员已经成功致病多种“自闭症小鼠”,使其表现出自闭症的社交障碍。小鼠虽不能代表人类,但对于帮助了解人类自闭症病理至关重要。众多实验中,一种近交系BTBR T+tf/J小鼠(简称BTBR小鼠)引起了研究人员的注意[5,6]。另外一种自闭症小鼠是通过在妊娠期间将母鼠大脑暴露于有毒化学物质,模拟病毒感染,而得到的后代自闭症幼鼠[7,8,17]。意外的是,研究人员只需灭活小鼠的一个基因,就可以抑制大脑产生硫酸乙酰肝素能力,而使小鼠患上自闭症。特异性酶对其合成至关重要[9]。基因的灭活需在幼鼠初生时完成。作者提到:“值得注意的是,这些突变小鼠几乎表现出自闭症的所有症状,包括社交缺陷,刻板行为,超声波发声能力降低等。”这些小鼠表现出的许多特点,尤其是肠道微生物遭到的破坏,都与自闭症儿童类似。

作为收割前干燥剂广泛用于农业生产,草甘膦的应用范围包括转基因大豆、抗草甘膦大豆、小麦、甘蔗等主要农作物。美国的食物严重受草甘膦污染,大量儿童深受其害。截至到2017年,美国国家疾控中心公布的自闭症发病率相当于36分之一,为历年最高。

2.硫酸乙酰肝素对脑室的影响

抑制小鼠大脑中硫酸乙酰肝素而导致小鼠自闭症,由此可以推测大脑中硫酸乙酰肝素缺陷可能是人类自闭症的关键致病因素。自闭症的许多致病基因与细胞外基质合成的酶密切相关[10]。这些酶是组织和器官的非细胞组分,它们不仅为组织和器官提供结构支撑,还起到诱导和协调许多生物力学及生物化学方面的作用,其中包括控制细胞对环境刺激的反应[11]。许多导致自闭症的基因突变都发生在糖原合成基因中,这些基因控制硫酸乙酰肝素表面的蛋白质和脂质,从而形成硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs),或参与糖基化过程[10](硫酸乙酰肝素和类似复杂糖链分子与蛋白质和脂质的结合)。

脑室是大脑中部的脑腔网络,充满脑脊髓液。硫酸乙酰肝素(HS)在其中作用十分重要,存在于“裂骨”状结构中,构成产生神经的干细胞[12]。在硫酸乙酰肝素蛋白多糖的指导下,干细胞增殖并分化成特定细胞并迁移到大脑中替换受损神经元。小鼠的研究说明,在胚胎早期发育阶段破坏硫酸乙酰肝素会导致严重的脑发育中断[13]。

上文提到近交系BTBR小鼠由于其自闭症性状而被广泛研究[5,6,14]。和大脑中硫酸乙酰肝素合成受损的小鼠一样,BTBR小鼠的大脑中硫酸乙酰肝素含量也较低[14]。它们的大脑形态发育正常,唯一的缺陷是缺少胼胝体,胼胝体是联络左右大脑半球的纤维构成的纤维束板胼,在脑室上方形成空隙。它由紧密排列的白色物质组成,由大量的轴突包裹在液体髓鞘中组成。研究人员在自闭症儿童大脑髓鞘也发现此种异常异物,其形成同样来源于髓鞘[15]。值得注意的是,有些人的大脑中缺失或胼胝体含量较少,却可以正常社会生活。研究同时发现,半数含有此缺陷的儿童表现出自闭症[16]。

 

3. BTBR小鼠的肠道致病

一项关于BTBR小鼠的开创性研究证实了肠道问题对自闭症的影响,提出肠道问题通过和脑的相互作用而导致自闭症[18]。该研究的最重要成果是观察到了肝脏中胆汁酸合成,以及肠道细菌的进一步变化。通常认为,肝脏从胆固醇中合成胆汁酸并将它们与牛磺酸或甘氨酸结合,然后运送到肠道或在胆囊。肠道细菌(主要是双歧杆菌)负责将共轭胆汁酸分离,释放出牛磺酸或甘氨酸分子,以供代谢。只有如此,胆汁酸才可以被其他肠道细菌(以布劳特氏菌属为主)分解为二级胆汁酸。因此,不同胆汁酸对于肠壁的蠕动和其他功能具有不同的影响。

BTBR小鼠的肝脏中缺乏胆汁酸,且具有二次合成胆汁酸的缺陷,不能通过微生物合成二级胆汁酸。以上说明了为什么双歧杆菌和布劳特氏菌属种群显著减少。

 

4. 草甘膦是BTBR小鼠自闭症的病因吗?

不难看出,小鼠的异常指标可能由草甘膦引起。这些小鼠是多代室近交系小鼠的后代,它们几乎以转基因大豆或抗草甘膦大豆作物为食。小鼠的胆汁酸供应逐代减少,导致草甘膦的抑菌效果随着时间逐渐降低。因此,肠道微生物受到草甘膦的影响而呈病理分布,起到了抗生素和酶破坏剂的作用[19]。

胆汁酸的合成依赖于肝脏中的细胞色素P450酶(CYP),而草甘膦严重影响小鼠肝脏中CYP酶的表达[19,20]。一项家禽微生物群的研究表明,与其他物种相比,双歧杆菌对草甘膦高度敏感[21]。故而,由于其帮助分离胆汁酸,双歧杆菌含量会收到草甘膦的影响。作为氨酸的氨基酸类似物,草甘膦可以取代甘氨酸[22,23]。双歧杆菌作用是从胆汁酸中分离联草甘膦,使其直接与草甘膦发生反应。

BTBR小鼠的5-羟色胺合成还出现受损,导致肠蠕动减慢和便秘以及小肠杆菌过度繁殖(SIBO)。这也是由于草甘膦的存在,破坏了芳香族氨基酸的合成[19]。肠道微生物产生必需氨基酸以供其宿主,其中色氨酸是合成血清素的原料。此外,研究还发现BTBR小鼠肠道中的乙酸盐含量降低,乙酸盐是一种短链脂肪酸,通常由肠道微生物(主要是双歧杆菌)在脂肪消化过程中产生[24],是克雷布斯循环的重要原料。研究还在自闭症人群中发现了肠道中乙酸盐减少,诱因是双歧杆菌数量的减少[25]。

 

5. 暴露于草甘膦中的小鼠研究

由于接触含有草甘膦的除草剂,幼年和成年雄性小鼠部分脑干细胞核中血清素呈现较低水平[26]。这与小鼠的体重降低、运动减少、焦虑抑郁呈现出相关性。大脑和肠道中产生的血清素在运输过程中都会被硫化,血清素转化成的褪黑激素也会被硫化。本文作者曾在2015年发表的一篇论文,文中提到草甘膦可以与铝共同作用,导致肠道和大脑中松果体功能失调[2]。松果体的作用是产生硫化的褪黑激素,在睡眠期间将其分布到心室的脑脊液中。文中曾提出褪黑激素的一项重要作用,是向神经元输送硫酸盐以保证硫酸乙酰肝素蛋白多糖中的硫酸盐供应。由于其细胞清理作用,硫酸乙酰肝素有助于人类睡眠,而睡眠障碍是自闭症的常见症状之一[27]。上述发现说明了BTBR小鼠大脑中硫酸乙酰肝素缺陷与其胃肠道功能紊乱紧密相连。

 

6. 牛磺酸:奇迹分子?

早在研究草甘膦前,我们就曾发表了一篇题为:“肝性脑病是自闭症人群获取硫酸盐的方式吗?”的文章 [28]。文中阐述了硫酸乙酰肝素在大脑中的关键作用,及其与自闭症相关性可能性。我们提出,在压力作用下,牛磺酸对大脑的硫酸盐供应起到重要作用。出人意料的是,人体细胞不消耗牛磺酸,饮食中的牛磺酸可通过肠道微生物转化为硫酸盐。大脑、心脏、肝脏都储存大量牛磺酸,在脑病(脑肿胀)或心脏病发作时释放到血液循环中。牛磺酸随后被肝脏吸收,与胆汁酸发生作用。肠道微生物分解牛磺酸,使其氧化成硫酸盐供血液使用。我们推测,胆汁酸在促进牛磺酸转化磺酸盐的过程中起着至关重要的作用,其机理可能是将牛磺酸分子定位与细菌膜上。通过亚硫酸盐氧化酶催化产生硫酸盐。由于从胆汁酸中分离牛磺酸的减缓,双歧杆菌受草甘膦的破坏而延缓肠道微生物将牛磺酸转化为硫酸盐。

 

7.梭菌过度增殖及疫苗诱导

除上述小鼠外,还有一种特殊的自闭症小鼠,这种小鼠是将孕期雌性小鼠暴露于类病毒环境。相关文献曾引起过极大关注,尤其是因为该实验证明了妊娠期小鼠肠道微生物繁殖与其后代孤独症之间的关联[7,8]。这些后代表现出典型的自闭症行为,并在大脑皮感层皮质特定的区域内发现斑块状无组织皮质细胞结构,说明其大脑发育受到破坏。

该文章指出,只有孕期小鼠肠道某种丝状梭菌菌株含量较高,其后代才会患自闭症,这也导致母鼠免疫系统出现“Th17”型免疫反应。肠道和大脑之间的联系导致胎儿小鼠直接受免疫反应影响。病毒类分子聚肌胞苷酸(poly(I:C))在胚胎发育12.5天侵入大脑。

聚肌胞苷酸并不是细胞,但能够欺骗大脑的免疫系统,使大脑误以为受到细胞入侵而产生免疫反应而导致过度反应,从而影响子代小鼠的大脑发育。出人意料的是,只有肠道微生物分布有利于呈现出利于丝状梭菌属繁殖时,子代小鼠才会导致自闭症。

一项更早的研究将注射聚肌胞苷酸的小鼠与梭菌过度生长联系起来,认为其机理与某些有毒物质释放有关,并提出该毒素直接导致自闭症[17]。其有毒物质是梭菌产生的酚类代谢物,如4-乙基苯基硫酸盐(4EPS)和对甲酚硫酸盐。实验中母鼠的后代血清4EPS着增加45倍,体内甲酚硫酸盐含量明显增高。该现象与小鼠血液、胎盘和氨基酸中的炎症因子升高相关。值得一提的是,用4-乙基苯基硫酸钾对年轻的健康小鼠进行为期3周的作用也能够诱发小鼠自闭症。此外,通过脆弱拟杆菌益生菌处理,可以改善由聚肌胞苷酸引起的自闭症小鼠后代的症状。

 

以上重要实验说明肠道中梭菌过度生长可能诱发接种流感疫苗的孕妇产生类似反应。上文提到的家禽实验说明,不同梭菌属中的草甘膦严重缺乏敏感性。草甘膦还会导致肠露症,原因可能与BTBR小鼠实验中的胆汁酸稳态中断有关[18],或者是通过诱导中肠上的肠细胞中的纤连蛋白的合成而直接引发肠露症[29]。肠露会导致脑部异常,纵使疫苗流感病毒进入孕期小鼠的大脑,引发炎症并导致信号级联放大而影响幼鼠发育。幼鼠大脑皮感层因此受到损伤。皮感层中神经元的活动取决于左右脑半球之间的的胼胝体的神经纤维发育,而这个过程可用破伤风毒素等抑制[30]。

 

8.人类与小鼠实验的一致性

近期,William Shaw针对一对三胞胎(二男一女)展开了研究[31]。诊断结果是,两个男孩都患有自闭症,女孩患有癫痫症。研究发现三个孩子的尿液中都含有大量草甘膦,他们的肠道中梭菌属物种的表达都高于正常水平,梭菌属通过释放酚类有毒代谢物诱发病变。2017年的另一项研究表明,患有炎症性肠病的自闭症儿童肠道中布劳特氏菌属减少(胆汁酸代谢受损),色氨酸降低及血清素同型异常导致其他梭菌属的含量增加和“Th17”细胞的过度表达,以上结果与小鼠实验的结论吻合[32]。

9.结论

肠道微生物组的破坏(可由草甘膦引起)导致肠道屏障渗漏,脑屏障渗漏和胎盘屏障受损。这使得铝等有毒物质、酚类化合物、草甘膦、来自疫苗的活病毒和内毒素侵入大脑,破坏胎盘而使胎儿受到伤害。免疫系统的过度反应破坏了神经元的发育并导致小鼠或胎儿患自闭症。

BTBR小鼠在暴露在草甘膦中并经过多代近亲繁殖后患上自闭症。以此研究为基础,BTBR小鼠在有机食物和清洁的水源条件下多代繁殖的结果值得期待。他们的后代能摆脱自闭症吗?如果能,那么我们便进一步了解了饮食健康的重要性,并进一步证实草甘膦是自闭症的致病。

参考文献:

[1] Swanson N, Leu A, Abrahamson J, Wallet B. Genetically engineered crops, glyphosate and the deterioration of health in the United States of America. Journal of Organic Systems 2014; 9: 6–37.
[2] Seneff S, Swanson N, Li C. Aluminum and Glyphosate Can Synergistically Induce Pineal Gland Pathology: Connection to Gut Dysbiosis and Neurological Disease. Agricultural Sciences 2015; 6: 42–70.
[3] Beecham JE, Seneff S. Is there a link between autism and glyphosate–formulated herbicides? Journal of Autism 2016; 3:1.
[4] Beecham JE, Seneff S. The Possible Link between Autism and Glyphosate Acting as Glycine Mimetic – A Review of Evidence from the Literature with Analysis. J Mol Genet Med 2015; 9:4
[5] McFarlane HG, Kusek GK, Yang M, Phoenix JL, Bolivar VJ, Crawley JN. Autism–like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes Brain Behav. 2008;7(2):152–63. Epub 2007 Jun 7.
[6] Scattoni ML, Ricceri L, Crawley JN. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav 2011; 10:44–56.
[7] Kim S, Kim H, Yim YS, Ha S, Atarashi K, Tan TG, Longman RS, Honda K, Littman DR,, Choi GB, Huh JR. Maternal gut bacteria promote neurodevelopmental abnormalities in mouse offspring. Nature 2017;549: 528–532.
[8] Yim YS, Park A, Berrios J, Lafourcade M, Pascual LM, Soares N, Kim JY, Kim S, Kim H, WSaisman A, Littman DR, Wickersham IR, Harnett MT, Huh JR, Choi GB. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature 2017;549: 482–487.
[9] Irie F, Badie–Mahdavi H, Yamaguchi Y. Autism–like socio–communicative deficits and stereotypies in mice lacking heparan sulfate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Mar 27; 109(13): 5052–5056.
[10] Dwyer CA, Esko JD. Glycan susceptibility factors in autism spectrum disorders. Mol Aspects Med. 2016;51:104–14.
[11] Frantz C, Stewart KM, Weaver VM The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci 2010 123: 4195–4200.
[12] Mercier F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cell. Mol. Life Sci. 2016; 73:4661–4674.
[13] Inatani M, Irie F, Plump AS, Tessier–Lavigne M, Yamaguchi Y. Mammalian brain morphogenesis and midline axon guidance require heparan sulfate. Science. 2003;302(5647):1044–6.
[14] Mercier F1 Kwon YC, Douet V. Hippocampus/amygdala alterations, loss of heparan sulfates, fractones and ventricle wall reduction in adult BTBR T+ tf/J mice, animal model for autism. Neurosci Lett. 2012;506(2):208–13.
[15] Deoni SC, Zinkstok JR, Daly E, Ecker C; MRC AIMS Consortium, Williams SC, Murphy DG. White–matter relaxation time and myelin water fraction differences in young adults with autism. Psychol Med. 2015 Mar;45(4):795–805.
[16] Lau YC, Hinkley LB, Bukshpun P, Strominger ZA, Wakahiro ML, Baron–Cohen S, Allison C, Auyeung B, Jeremy RJ, Nagarajan SS, Sherr EH, Marco EJ. Autism traits in individuals with agenesis of the corpus callosum. J Autism Dev Disord. 2013 May;43(5):1106–18.
[17] Hsiao EY, McBride SW, Hsien S, Sharon G, Hyde ER, McCue T, Codelli JA, Chow J, Reisman SE, Petrosino JF, Patterson PH, Mazmanian SK. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 2013;155(7):1451–63.
[18] Golubeva AV, Joyce SA, Moloney G, Burokas A, Sherwin E, Arboleya S, Flynn I, Khochanskiy D, Moya–Pérez A, Peterson V, Rea K, Murphy K, Makarova O, Buravkov S, Hyland NP, Stanton C, Clarke G, Gahan CGM, Dinan TG, Cryan JF. Microbiota–related Changes in Bile Acid & Tryptophan Metabolism are Associated with Gastrointestinal Dysfunction in a Mouse Model of Autism. EBioMedicine.2017;;24:166–178.
[19] Samsel A, Seneff S. Glyphosate’s Suppression of Cytochrome P450 Enzymes and Amino Acid Biosynthesis by the Gut Microbiome: Pathways to Modern Diseases. Entropy 2013; 15: 1416–1463.
[20] Hietanen E, Linnainmaa K, Vainio H. Effects of phenoxyherbicides and glyphosate on the hepatic and intestinal biotransformation activities in the rat. Acta. Pharmacol. Toxicol. 1983; 53: 103–112.
[21] Shehata AA, Schrödl W, Aldin AA, Hafez HM, Krüger M. The Effect of Glyphosate on Potential Pathogens and Beneficial Members of Poultry Microbiota in Vitro. Current Microbiology 2013; 66: 350–358.
[22] Ssmsel A, Seneff S. Glyphosate pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016;16: 9–46.
[23] Qingli Li,1,2 Mark J Lambrechts,1 Qiuyang Zhang,1 Sen Liu,1 Dongxia Ge,1 Rutie Yin,2 Mingrong Xi,2 and Zongbing You1 Glyphosate and AMPA inhibit cancer cell growth through inhibiting intracellular glycine synthesis. Drug Des Devel Ther. 2013; 7: 635–643.
[24] Fukuda S, Toh H, Hase K, Oshima K, Nakanishi Y, Yoshimura K, Tobe T, Clarke JM, Topping DL, Suzuki T, Taylor TD, Itoh K, Kikuchi J, Morita H, Hattori M, Ohno H. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature 2011;469(7331):543–7. [25] Adams JB, Johansen LJ, Powell LD, Quig D, Rubin RA. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism–comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterol. 2011 Mar 16;11:22.
[26] AitBaliY,Ba–MhamedS,BennisM.Behavioralandimmunohistochemicalstudyofthe effects of subchronic and chronic exposure to glyphosate in mice. Front. Behav Neurosci 2017; 11: 146.
[27] Devnani PA, Hegde AU. Autism and sleep disorders. J Pediatr Neurosci. 2015 Oct–Dec; 10(4): 304–307.
[28] Seneff S, Lauritzen A, Davidson R, Lentz–Marino L. Is Encephalopathy a Mechanism to Renew Sulfate in Autism? Entropy 2013; 15: 372–406.
[29] Gildea JJ, Roberts DA, Bush Z. Protective Effects of Lignite Extract Supplement on Intestinal Barrier Function in Glyphosate–Mediated Tight Junction Injury. Journal of Clinical Nutrition and Dietetics 2017;3(1):1.
[30] Wang CL, Zhang L, Zhou Y, Zhou J, Yang XJ, Duan SM, Xiong ZQ, Ding YQ. Activity–dependent development of callosal projections in the somatosensory cortex. J Neurosci. 2007;27(42):11334–42.
[31] Shaw W. Elevated Urinary Glyphosate and Clostridia Metabolites With Altered Dopamine Metabolism in Triplets With Autistic Spectrum Disorder or Suspected Seizure Disorder: A Case Study. Integrative Medicine 2017;16(1): 50–57.
[32] Luna RA, Oezguen N, Balderas M, Venkatachalam A, Runge JK et al. Distinct Microbiome–Neuroimmune Signatures Correlate With Functional Abdominal Pain in Children With Autism Spectrum Disorder. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2017;3(2):218–230.

What We can Learn from Mouse Models of Autism. by Stephanie Seneff is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 United States License.

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *